杨康文，上海理工大学

郝强，广东朗研科技有限公司

引言

光学显微镜是拍摄生物组织或者细胞图像的主要手段。传统显微镜通常采用白光照射样品，基于测量吸收、散射和折射率的变化实现光学成像，但缺乏对细胞内特定化学物质的分辨能力。荧光显微镜采用单色连续光照射样品，通过将荧光分子与生物体内的特定蛋白结合来区分化学物质，但是，荧光探针受限于光毒性、光漂白等。

非线性光学显微成像采用超短脉冲激光照射样品，基于强场激光的非线性效应获取高特异性、高空间分辨的图像，包括无需标记的相干反斯托克斯拉曼散射成像（CARS）、受激拉曼散射成像（SRS）、二次谐波（SHG）、三次谐波成像（THG），以及采用荧光蛋白标记的双光子成像（2PM）和三光子成像（3PM）。

非线性光学显微成像的不断发展对超短脉冲激光光源提出了许多新需求，如相干拉曼散射成像需要时间同步、空间重合、波长差匹配拉曼振转能级的双波长超短脉冲激光。进一步，为实现高速率、高光谱的相干拉曼成像，还需要激光波长调谐速度更快、光谱覆盖范围更宽。

双光子成像常采用中心波长920 nm或1030 nm的飞秒激光，脉冲宽度一般要求在百飞秒附近，几十飞秒更佳。此前，通常采用的是钛宝石飞秒激光器或者固体激光泵浦光参量振荡器，但这类光源体积较大、结构复杂，需要安装于恒温恒湿的超净环境，也需要专业人员提供定期维护。光纤超短脉冲激光器体积小、重量轻、稳定性强、光束质量好、脉冲能量适中，已成为非线性光学显微成像技术迈向实际应用的重要推手，发展潜力巨大。

超短脉冲光纤激光器在生物成像中潜力无限

1.光纤参量振荡器应用于窄带CARS系统

窄带CARS成像是针对某个特定的拉曼频率，采用两束窄带光谱皮秒脉冲激发的相干拉曼散射成像，可用于对脂滴进行成像进而研究细胞代谢和癌症病状。传统固体光源一般为两路输出的空间激光，需要采用时间延迟和空间重合的光路硬件，结构较为复杂、体积稍大。朗研光电的技术团队开发了基于光纤结构的参量振荡器，泵浦光经过光子晶体光纤产生四波混频效应。如此，泵浦光和信号光可从同一光子晶体光纤输出，具有时间自同步、空间自重合的特点，可直接应用于窄带CARS成像，极大减小了光源的体积和系统复杂度。

为了探测不同的振转能级，需要激光波长可调谐；为了实现对不同密度生物样品的无损伤激发，需要脉冲重频可控制；为了分辨相邻的拉曼谱线，需要激光光谱宽度更窄。为此，朗研光电的技术团队提出了基于偏振操控的色散滤波、有理数谐振、腔内放大新方案，实现了波长连续可调谐、重频比例可控制、光谱宽度可二次压缩的双波长超快激光输出。通过长光纤提供的时间延迟和色散滤波，实现了970-1025 nm的可调谐信号光输出；提出了基于偏振调谐的波段选择方案，产生了780-791 nm和960-1000 nm带间可切换、带内可调谐的脉冲输出；基于有理数谐振的参量振荡器，在不改变腔长的情况下，实现重复频率在0.5-6.0 MHz范围内的灵活控制；采用在参量振荡器中内置光放大器的有源反馈腔结构，在提升信号光功率的同时，有效抑制了光谱展宽[1]。图1为朗研光电和深圳大学共同研制的CARS光谱成像仪。

2.飞秒光纤同步光源应用于术中无标记病理成像

基于受激拉曼散射的无标记病理成像，在癌细胞检测、术中高精度切缘分析方面潜力巨大。受激拉曼散射成像对光源的相对强度噪声要求极高，前述光纤参量振荡器的噪声水平一般难以达到。采用主动或被动光学同步的两台超短脉冲激光器，能有效避免非线性效应引起的相对强度噪声。同时，从能量转换效率的角度来看，相比于光子晶体光纤频率变换技术，激光器直接输出的平均功率更高。在光学同步技术方案中，主动同步方案所采用的电子反馈方式稍显复杂，而基于非保偏光纤的被动光学同步方案腔长失配距离较短，稳定性易受环境干扰。

针对这一难题，我们提出并验证了一种基于全保偏光纤的主-从注入全光被动同步方案。该方案采用掺铒和掺镱锁模光纤振荡器，结合光学倍频和非线性展宽产生波长可调谐的双色皮秒脉冲，已应用于受激拉曼散射成像及中红外上转换探测等研究领域。

其中，光谱展宽模块的设计对于光源的调谐性能和噪声表现至关重要。由于光子晶体光纤的空间耦合光路结构复杂、全光纤熔接一致性差，为实现宽调谐、低噪声的光谱展宽，我们设计并验证了基于单模光纤或增益光纤的全光纤展宽结构。采用长度为百米量级的单模光纤，实现了1018-1051 nm的光谱展宽；通过色散管理的掺镱光纤放大器，仅采用增益光纤，产生了1012-1068 nm的宽带抛物线脉冲。

2024年，通过管理掺镱光纤放大器的非线性光谱演化过程，研制成功针对水分子、蛋白和脂类分子的同步飞秒激光，输出双波长的典型参数为785 nm/120 fs/200 mW和1025 nm/250 fs/1 W。近期，该同步光源已安装于医用手推车上，用于开展受激拉曼散射成像和术中无标记病理检测。

3.多波长光纤超短脉冲光源应用于小鼠肾切片双光子成像

双光子显微镜相比传统单光子荧光显微镜，具有空间分辨率高、穿透距离深、细胞毒性小等特点，在生物成像中发挥着重要的作用。随着绿色荧光团和荧光蛋白的广泛使用，920 nm波段的飞秒激光成为主要光源。掺镱光纤激光器输出功率高、脉冲宽度窄，技术和器件发展相对成熟。通过光子晶体光纤进行非线性光谱展宽，利用滤光片选择所需波长，可获得宽带可调谐的飞秒激光。

基于上述方案，朗研光电的技术团队实现了926 nm激光脉冲输出，脉冲宽度88 fs，脉冲能量4.0 nJ，重复频率78 MHz。中国科学院苏州生物医学工程技术研究所采用该光源实现了小鼠肾切片的双光子荧光图像（见图3）。此外，掺镱光纤激光器输出的1030 nm波长可用于激发红色荧光蛋白，结合频率变换和滤波系统后，有望通过一台飞秒激光器实现多色双光子成像。

4.绿色皮秒光纤激光应用于无标记生物物理快速成像

定量相位显微成像是一种无标记、非侵入的显微成像技术。相较于相干拉曼散射测量分子振转能级的方法，定量相位成像是一种生物物理成像方案。它通过激发光与细胞的相互作用产生相位变化，提取出细胞大小、形态和内部结构等信息。传统定量相位显微成像的速度在kHz量级，主要受限于光学相机。采用超短脉冲激光结合高速光电探测可极大提升定量相位显微成像的速度。

香港大学Kevin K.M.Tsia课题组通过采用自由空间角度啁啾延时装置，将重复频率10 MHz、平均功率1 W、脉冲宽度15 ps的超短脉冲分散成近百个空间分布、时间延迟的扫描光点，与微流控系统结合后，实现了MHz量级线扫描速度、每秒1万个细胞左右的吞吐量。这种基于空间啁啾的分光方案对激光光束质量提出了极高要求，光斑需满足传输数十米之后依然维持较好的形状，图四是他们采用高速定量相位成像系统测量的细胞生物物理图像与荧光标记成像图像对比。

光学显微镜打开了微观世界的大门，让细胞清晰的展现在人类眼前。超短脉冲激光与光学显微镜的结合，催生出相干拉曼、多光子等新颖的非线性光学成像技术，目前正朝着小型化、多模态、高速度、内窥镜等方向发展，将推动光学成像用于临床检测与术中辅诊中。

作者简介：

杨康文，上海理工大学副教授，博士生导师，上海理工大学志远学者，香港大学访问助理教授，香港先进生物医学仪器中心博士后研究员。2014年博士毕业于华东师范大学精密光谱科学与技术国家重点实验室，研究方向为超快光纤激光在生物医学成像领域的应用。

郝强，上海理工大学副教授，广东朗研科技有限公司总经理。主要从事超快激光技术研发和应用推广工作，参与了科技部国家重大仪器专项、国家重点研发计划等项目，发展了多波段超短脉冲高可靠锁模和低噪声放大技术，研发了系列超快激光光源并实现产业化等。

参考文献：

郑世凯, 杨康文, 敖建鹏,et al.光纤式相干拉曼散射成像光源研究进展中[J].中国激光, 2019, 46：508008.

K. Yang, Y. Shen, J. Ao, et al.Passively synchronized mode-locked fiber lasers for coherent anti-Stokes Raman imaging[J]. Opt. Express, 2020, 28：13721-13730.

P. Wang, X. Xu, Z. Guo, et al.926 nm Yb-doped fiber femtosecond laser system for two-photon microscopy[J]. Appl. Phys. Express, 2019, 12:32008.

G. Yip, M. Lo, W. Yan,et al.Multimodal FACED imaging for large-scale single-cell morphological profiling[J]. APL Photonics, 2021, 6:70801.

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